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微生物发酵是重要的工业生产手段之一。相比于一般的化学合成和植物提取,微生物发酵条件温和,能利用易获取的廉价底物快速繁殖,具有产量高、易转化、周期短、易于提取纯化等优点。随着医药和食品领域发展,微生物发酵产品需求多元化,天然菌株中缺乏所需产物的代谢途径,或其代谢途径调控复杂,所需产物难以实现过量积累。

微生物作为合成生物学研究的重要载体,合成生物学技术的出现使工程菌种研究获得了全新的机遇,合成生物技术的发展更是极大地提升了被构建工程菌的生产能力。在合成生物学研究中,微生物通常被设计并改造成细胞工厂,应用于不同产品的生产。吉林农业大学食品科学与工程学院,小麦和玉米深加工国家工程实验室的高 欣、柳羽哲、闵伟红*等概述合成生物学技术,综述借助编辑工具和生物元件进行代谢通路的移植或动态调控构建工程菌,并介绍利用所构建工程菌在生产氨基酸、有机酸、芳香族化合物、糖类中的应用。

1、合成生物学技术方法

基因编辑工具

规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR关联蛋白(Cas)系统是新涌现的基因编辑工具,能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。该工具的开发为构建更高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台。2013年,Le Cong等报道了CRISPR/Cas系统能同时编辑哺乳动物基因组中的多个位点,作为一种RNA引导的内切核酸酶系统,它可以直接通过核苷酸碱基配对靶向DNA位点。与传统基因编辑工具相比较,CRISPR系统作为一种新型编辑工具,具有省时、易构建、精度高等特点,以CRISPR系统为代表的新型基因编辑技术飞速发展,在诸多生物学领域中得到广泛应用,成为近年基因组编辑的热门工具,当前已被广泛应用于基因敲除、基因沉默和基因激活等方面,极大扩展了基因编辑技术的应用范围,如图1所示。

基因组合成方法

随着近10 年合成生物学飞速发展,越来越多的科研团队都致力于用合成DNA来构建复杂的基因系统。细胞自身基因组的人工改造自然而然地进入了人们视野。2008年,Venter研究所用化学合成的DNA构建出580 000 bp支原体基因组的完整副本;2016年,该研究所重新设计了之前合成的支原体基因组,删除部分被认定为生长非必需的基因和DNA,被删除部分约占全基因组的一半。这项工作未对基因进行任何编码,保留的基因组部分与自然序列相同,但它是目前人为改造最多的基因组,它的基因内容和布局与天然基因组相比有很大差异。

2、合成生物学设计理论

生物元件设计与动态调控

基础元件设计:生物元件是生命体内具有最基础生物功能的基本结构单元,例如调控基因表达的调控元件,包括启动子、终止子、核糖体结合位点(RBS)以及特定功能的结构元件(如天然产物合成途径中酶基因)。近年来随着对启动子序列核心元件和上游激活序列认识的不断提高,人工杂合启动子的开发和应用正在迅速发展。将来有望获得序列更短、性能更强的启动子,从而有利于实现对模式菌中所引入的复杂通路进行更有效的调控。通过构建文库的方法来设计启动子或RBS等调控元件非常有效,但文库构建与元件筛选效率较低,不适用于需要大量调控元件的人工生物系统构建,此外许多元件无法快速进行文库筛选。因此建立一套完整的启动子的强度预测模型至关重要。

传感器与开关设计:借助生物传感器进行动态调控,可以取代常规基因敲除,从而解决因基因敲除导致的菌体生长不良影响产量这一问题。目前生物传感器主要包括荧光共振能量转移传感器、核糖开关传感器和转录因子传感器。

荧光共振能量转移传感器由于操作简单、敏感性高、反应速度快的特点常用于食品安全检测领域,例如对赭曲霉毒素A的检测。核糖开关对配体的响应更为快速,结构简单易于改造,更适用于基因表达的动态调控。王兴设计了对异丙基硫代半乳糖苷浓度具有高灵敏度的传感体系,包括产生信号分子LuxI蛋白表达元件和能接受信号分子的刺激产生绿色荧光蛋白的感应元件。转录因子传感器借助转录因子识别和结合基因启动子区的元件来控制下游基因表达,其调控基因表达的特性适用于建立细胞工厂,例如筛选高活性酶及高产菌、动态调控蛋白表达。

蛋白质设计

根据目前的认知水平,功能生物元件的完全从头设计有是一项艰难的挑战,特别是在氨基酸序列与高级结构确定方面。许多蛋白质元件缺少高通量模型,无法快速进行文库筛选获得具有预期功能的突变体。因此根据掌握的元件序列与功能之间存在的特殊关系建立计算机模型,对元件的关键位点进行改造,理性设计具有预期功能和控制特性的元件是元件设计的重要方向。在蛋白质元件设计上,可以基于已知元件结构和功能间的关系,替换编码生物元件的DNA序列,或引入编码非天然氨基酸序列,获得转化的蛋白质元件;其次可以根据大规模定向进化筛选,将随机变异导入编码生物元件DNA中,用合适的筛选方法进行大规模筛选,得到期望的蛋白质生物元件;还可以利用计算模拟,定向设计与合成蛋白质中拓扑结构,利用从头设计合成出具有特殊结构的蛋白质。

合成线路与合成网络设计

基于合成生物元件,对多个元件进行串联或并联,组成了具有处理信息能力和干预生命体功能的合成基因线路。合成基因线路设计首先需要构建基础功能元件,如拨动开关、感应器等,然后进行元件组装,构建复杂的功能线路。基因线路的人工合成有助于对菌体自身基因组的删减,基因组简化能提升人们对基因组功能的认知,创造精简高效的工程菌,如删除菌体代谢调节网络的重复部分、稳定插入的外源基因、优化菌体代谢途径以及加强菌体对物质和能量的利用。近年来,合成基因线路的设计取得一些进展,科学家们构建出了基因传感器和具有所需强度的调控元件、基因表达动态控制器和生物触发器等一批功能组件。基于当前的研究,在单个细胞内构建的合成基因线路,难以携带大量的人为附加元件。基因表达的竞争和噪声限制了基因线路规模化,而降低噪声通常需要增加基因表达强度,使得细胞内有限的资源和能量分配紧张。

3、合成生物学构建微生物工程菌的应用

氨基酸

合成生物学技术的发展对氨基酸发酵生产行业具有较大的推动作用,不仅能提升传统氨基酸产品的产量,还可以获得产特殊氨基酸产品的工程菌。Zhou Libang等使用赖氨酸核糖开关和细胞内L-赖氨酸作为信号来控制与赖氨酸生物合成相竞争的必需代谢旁路,较一刀切的传统改造手段,降低了对菌体生长和代谢影响。龙梦飞设计出能动态调控α-酮戊二酸脱氢酶活性的基因调控线路,并利用该调控系统下调支路关键酶活性,较传统敲除支路手段,其小幅度变动宿主原基因组,提高了反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。

芳香族化合物

含有双键和单键交替的不饱和环的芳香族化合物在工业上应用广泛,例如作为添加剂被使用在药物、农用化学品、食品、饲料和化妆品中。芳香族化合物主要通过化学合成,也可以通过提取从植物中获得。由于一系列资源及环境问题,利用可再生生物质生产芳烃的生物技术越来越受到关注。许多微生物能够分解代谢过多的芳香族化合物,拦截这些代谢途径可能导致生物技术生产增值芳香族化合物,研究者重点关注莽草酸途径这一生成芳香族氨基酸和其他多种芳香族化合物的重要途径。莽草酸途径中,最终产物4-羟基苯甲酸(4HBA)是一种在防腐杀菌方面有利用价值的原料。

糖类

氨基葡萄糖(GlcN)常用作膳食补充剂,GlcN及其衍生物N-乙酰氨基葡糖胺(GlcNAc)具有控制疼痛、改善功能和延缓关节结构改变功效,在医药领域广泛应用。刘延峰在枯草芽孢杆菌中共表达D-葡糖胺-6-磷酸合成酶和D-葡糖胺-6-磷酸乙酰化酶,成功构建GlcNAc合成途径,实现GlcNAc在枯草芽孢杆菌中积累。在该重组枯草芽孢杆菌基础上,对GlcNAc合成途径关键酶进行调控,采用双启动子系统优化GlcNAc合成途径中关键酶表达,严谨型启动子PxylA调控D-葡糖胺-6-磷酸合成酶表达,并抑制分支代谢途径,获得高产重组菌株。

有机酸

发酵法被应用于多种有机酸生产,有机酸在医药领域需求广泛,因此有机酸生产已经逐渐成为发酵产业的重要部分。莽草酸是合成抗病毒药物奥司他韦的关键中间体,其衍生物具有抗肿瘤、防止血栓形成等多种功效,可以通过化学合成、微生物发酵和从某些植物中提取来获得,由于植物提取成本高,通过发酵在重组微生物中生产莽草酸可能成为既定的优选途径。侯建屾等利用生长依赖启动子和去电子构建了动态分子开关,这种动态分子开关将细胞生长与莽草酸合成分开,发酵72 h后生成莽草酸14.33 g/L。Liu Chang等根据大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌遗传密码子使用偏好性,构建适配性增强的3-脱氢奎宁酸脱水酶元件库,为合成生物学应用定制了新DNA序列,并获得可用于设计代谢工程和合成生物学的莽草酸途径人工模块。

天然产物

天然产物结构复杂多样,具有多种活性,但其天然合成途径和代谢调控较复杂,需要对宿主合成途径进行系统设计和改造,以提高天然产物的生物合成效率。随着合成生物学技术日益成熟,异源表达已被广泛应用于天然产物生产。梁蓉等利用毕赤酵母真核表达体系实现拟南芥AtPOFUT1蛋白异源表达,初步检测明确了该重组蛋白具有O-岩藻糖基转移酶活性。Paddon等通过重新改造合成途径过表达植物脱氢酶和细胞色素P450,使得青蒿酸在酿酒酵母中发酵产量达到25 g/L,为青蒿素化学合成的前体大量生产提供了可能。

结 语

合成生物学相关技术研究为构建和生产预期化合物工程菌株提供了强有力技术支撑,是发酵工业领域研究的重要方向。采用合成生物学技术构建高效微生物工程菌,能够在保持菌体生长正常,使工业微生物在代谢稳定的基础上提高已有的产能和生理性能。将合成生物学工具应用于定向进化,能缩短工程菌定向进化周期,增加突变体筛选效率,将其应用于代谢工程,在将生物系统作为一个整体进行工程改造前提下,通过动态控制各复杂途径表达量,可以迅速提升产品多样性。以开发氨基酸、GlcN等功能性成分为代表的工程菌发酵研究目前取得了显著进展。在理论研究、技术探索和借鉴典型合成回路的基础上,进一步扩宽合成的目标范围、构建智能化工程菌和实现大规模生产是未来合成生物学技术的重要方向。

通信作者简介

闵伟红教授,吉林农业大学食品科学与工程学院院长,二级教授,博士生导师。吉林省优秀教师,吉林省拔尖创新二层次人才,吉林省突出贡献中青年专家,吉林省青年科技奖获得者,吉林省高校新世纪科学技术优秀人才,吉林省好人-最美教师团队成员,中国农业工程学会农产品加工与贮藏分会常务理事。吉林农业大学轻工技术与工程一级学科带头人,吉林农业大学教学名师,吉林农业大学食品科学与工程学院院长,从事酶分子改造及食品营养分子调控研究,在AK定向进化及改造,活性肽降低氧化应激对神经细胞的保护作用和改善学习记忆能力等方面取得了阶段性突破。近五年主持承担国家自然科学基金面上项目、国家“863”计划、国家“十二五”科技支撑项目、国家科技部农业成果转化资金项目、吉林省科技厅科技重点课题等国家、省部级课题11项,累计经费1500万元;获国家科技进步二等奖和中华农业科技成果一等奖各1项,在Food Chemistry,Journal of Agricultural and Food Chemistry等国外期刊发表 SCI论文19篇(top期刊6篇),EI论文15篇,获发明专利4件。指导博士、硕士研究生87人,其中留学生3人。

本文《合成生物学构建微生物工程菌研究进展》来源于《食品科学》2022年43卷15期256-264页,作者:高欣,柳羽哲,江泽沅,曾琦,刘诗梦,刘晓婷,闵伟红。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210831-414。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑:袁艺;责任编辑:张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网。

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